酶切体系的建立

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 一、 成立一名准则的酶切不起作用近些年大都数探索者依照一条什么细则，即10个行业的内切酶是可以切割工作1μg有所不同种类和纯净度的DNA。一般 ，一款50μl的影响体系中中，1μl的酶在1X NEBuffer终含量及根据摄氏度状态下影响1小時能够降解塑料1μg已纯化好的DNA。比如申请加入更大的酶，则可根据不但缩减影响时；比如缩减酶的使用，对大多酶再说，根据增加影响时（不不低于16小時）也可*影响。二、 选恰当的酶显而易见，首选的酶在底物DNA上不错最起码有很大个相对的认别位点。认别碱缴费缴存基数目少的酶比碱缴费缴存基数目多的酶更过频地裁切底物。猜测是一些GC含锌量50%的DNA链，是一些认别4个碱基的酶将大概在每44（256）个碱基中裁切一回；而是一些认别6个碱基的酶将大概在每46（4096）碱基裁切一回。内切酶的化合物不错是粘的（3''或5''凸出端），也不错是平的场面描写。粘端化合物不错与混溶的其它的内切酶化合物联接，而一切的平端化合物都不错同时联接。相关联资料参与目次的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends篇文章。三、 酶内切酶可能取出冷库后应请马上至于冰上运动。酶应是zui后这个被放入到作用迟钝指标体系中（在放入酶以往所有的两种作用迟钝物都应以及加好并已预混）。酶的剂量视在底物上的激光切开频繁 而定。举例子，超槽式和包埋法激光切开的DNA往往必须要 高达1U/μg的酶这样才能被*激光切开。参照文件名第244和264之"激光切开质粒DNA"和"包埋法激光切开DNA"。四、 DNA待切割工作的DNA应有已除掉酚、氯仿、酒精、EDTA、去污渍剂或过少盐阴离子的危害，以避免要素酶的活性氧。DNA的甲基化也肯定是酶切要了解到的的因素。想关甲基化的玩法，参考第252页至253页之甲基化想关玩法。五、 降低液就每一位种酶NEB都打造合理的*抗震液，可保障可以说100%的酶活力。的使用时的抗震液氨水浓度应该是1X。有的酶规范100μg/ml的BSA以做到*活力。在这类状况下，我们公司也合理打造100X的BSA（10mg/ml）。不还要BSA的酶若果加了BSA不会受变小作用。介绍抗震液更详细分析的产品信息参看第234页。六、 不良反应密度内切酶力量工作机构的设定是：1个钟头内，50μl不良响应密度中，生物降解1μg的底物DNA想要的酶为一力量工作机构。往往酶：DNA的不良响应基数能够从选择。较小的不良响应密度更方便遭受移液器确定误差的引响。为了让将甘油的酸度调整在5%以內，要重视酶的密度别低于总密度的10%（通常酶都存储于50%的甘油中）。七、 相溶那是无比必要以至于不断地被删除文件的一步一个脚印。想得到响应*，要使响应液彻底相溶。企业推送用枪不停获取相溶，或者用力指轻弹内径相溶，如果再快捷离心力一番便可。特别注意：不得振荡器！八、 影响温大一些酶的想法室内气温为37°C；从嗜热菌中分头离出的内切酶则要高的室内气温。一样为50-65°C上下。参看第244页 Activity of thermophiles at 37°C。

九、 反应时间
　1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到*。参见第241页酶在反应中的存活时间。

十、 中断想法假若不做好下这的一步酶切症状，能用的 解除液来解除症状。在NEB我们大家的使用下面的症状解除液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl症状液）。假若要做好下这的一步酶切症状，能用的 热降解法解除症状（65°C或85°C，三十分钟左右）。热降解并没有实用在其它的酶，详细情况参考第240页热降解表。因此，酚/氯仿抽提也应该用在解除症状。五一、储放大绝大多数酶应放置于-20°C。少绝大多数酶则须在-70°C常年储存图片。宝贝详询参加相应酶的DATA SHEET 或文件目录相应绝大多数。10X BUFFER 和100X BSA于-20°C储存图片。BSA不要与NEBuffer混和后储存图片，以至于可能会显现BSA沉淀出的。第十二、不稳性相隔1-8个月均会对其它的酶有块个活性氧判断；zui近的一遍判断后果将被贴在出售的每个管酶上。能够 二三十来年来的成功经验，小编知道大有些酶在比较适合的维持保护液里在-20°C前提下极为可靠性。超过-20°C前提下可靠性性将进行有效降低。13、對照响应假设遇到您的DNA底物未能被获得成功切片，就能够进行比较进行实验以确定因为。实际的方式下述：将没加内切酶的底物DNA（待切底物）与融入了内切酶的对比DNA（有诸多知道酶切位点）直接做好发应。若调查导致揭示底物DNA生物降解，则说明书DNA在纯化时中或发应液里注入了核酸酶水污染；若调查导致察觉底物DNA保证完美，而对比DNA被出色剥开，则不错来排除酶水平的主要原因，此时此刻不错将对比DNA和待切底物DNA交织好又一次做好发应，以制定样件中是否有有阻止剂。要有阻止剂都存在（一般性是盐、EDTA或酚），则交织物里的对比DNA也始终无法 被剥开。